In lichaamscellen bevinden zich twee NF1-genen. Elk NF1-gen codeert voor het eiwit neurofibromine. Bij mensen met NF1 is één NF1-gen inactief door een mutatie, waardoor dat gen geen (goed) neurofibromine maakt. Het andere NF1-gen is wel actief en produceert wel neurofibromine. Maar helaas is dat te weinig neurofibromine.
Er is dus onvoldoende neurofibromine aanwezig in de cellen van iemand met NF1, waardoor het eiwit neurofibromine niet alle functies in voldoende mate kan uitvoeren. Dit wordt ook wel haploinsufficiëntie genoemd. Het tekort van neurofibromine vormt de basis van de symptomen, zoals die optreden bij mensen met NF1.
Onderzoeker Erik Wiemer van het Erasmus MC wil een methode ontwikkelen om het nog actieve wild-type NF1-gen meer neurofibromine te laten maken. Zodat het tekort aan het neurofibromine eiwit en daarmee de moleculaire symptomen zoals we die zien in NF1-cellen wordt opgeheven.
De basis van onze aanpak vormt de recent ontdekte CRISPR-CAS9 technologie, die het mogelijk maakt om het wild-type NF1-gen harder aan te zetten. Een aantal test-experimenten zijn veelbelovend, maar de aanpak moet verder ontwikkeld en geoptimaliseerd worden. Dit onderzoek richt zich daar op.
Helaas kan (en mag) de CRISPR methode nog niet worden toegepast in de mens en zijn er in dit verband ook nog een aantal technische problemen te overwinnen. Daarom wil dit onderzoek ook bestuderen of de aanmaak van neurofibromine op andere manieren verhoogd kan worden, bijvoorbeeld door bepaalde medicijnen. Hiervoor wordt een breed bruikbare screenings procedure ontwikkeld en wordt deze gebruiken voor een screening met circa 1500 klinisch toegepaste medicijnen. Dit project kan aanleiding geven tot gerichte klinische studies bij mensen met NF1, tot vervolg laboratorium onderzoek en uiteindelijk de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën.
Beloop
Eind 2019 is een test experiment uitgevoerd waarin geprobeerd is om de NF1-promoter te activeren met behulp van CRISPR-CAS9 / guide RNA constructen in Schwann cellijnen afkomstig van mensen met NF1. Deze initiële resultaten gaven aan dat de NF1 expressie op mRNA en eiwit niveau kan worden geïnduceerd.
Daarna is een luciferase-reporter construct gegenereerd, waarin de expressie van luciferase werd gecontroleerd door de NF1- promoter. Met behulp van deze reporter kan eenvoudig de efficiëntie van verschillende CRISPR-CAS9/guide RNAs, die op verschillende plaatsen aangrijpen op de NF1-promoter worden getest. Onder andere de Leidse master student Siddh van Oost en Anne Vriends MSc hebben een groot deel van deze proeven uitgevoerd.
Rond 2022 is er met de CRISPR-CAS9VP64 aanpak een “sweet-spot” in de NF1 promoter ontdekt. Als CAS9VP64 naar deze plek gedirigeerd wordt dan wordt er een tienvoudige activering van promoter activiteit gezien. Dat is veelbelovend! Ook een aantal andere plekken laten een activering zien die varieert van vijf- tot tweevoudig. Na deze resultaten is er gekeken of deze hoge activeringen ook in tumor en Schwann cellen van mensen met NF1 worden gezien en wat de gevolgen zijn voor neurofibromine eiwit niveaus en RAS signalering.
Update november 2025
In het laboratorium hebben we aangetoond dat de CRISPR-CAS9 techniek kan worden gebruikt om het NF1 gen te stimuleren. Dit gebeurt door het eiwit CAS9, met daaraan gekoppeld een transcriptioneel activator eiwit, op specifieke plaatsen in het promotor gebied van het NF1-gen te laten binden.
Vervolgens hebben we een medicijn screening uitgevoerd, waarin zo’n 1500 medicijnen zijn getest, om uit te zoeken of er medicijnen zijn die ook in staat zijn het NF1-gen te stimuleren. Op basis van de screen zijn een negental medicijnen geselecteerd voor nader onderzoek. Helaas laat geen van deze medicijnen een sterke en reproduceerbare activering van het NF1-gen zien die te vergelijken is met wat we waarnemen met de CRISPR-CAS9 aanpak.
In de komende tijd willen we ons dus verder richten op het verder valideren, in verschillende cellijnen, van het CRISPR-CAS9 effect waarbij met name geconcentreerd wordt op de neurofibromine expressie en de activiteit van het RAS signalerings pad.
